液相色谱分析常见问题
弘林仪器：2017-10-13 阅读数：
高效液相色谱(High Performance Liquid Chro—matographv．HPLC)是近3O年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离、分析技术。它既能用于微量组分的分析测定．又能用于大量的制备分离．灵活多样，应用范嗣已超过其它各种分离方法．高效液相色谱仪在使用过程中常会出现一些影响分析结果的问题．
1.漂移问题
主要包括基线漂移和保留时间漂移
1．1 基线漂移
一般说来．机器刚启动时．基线容易漂移．大概要30min的平衡时间， 如果用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下(220nm)平衡时间相对会比较长，但如果在实验过程中发现基线漂移，则要考虑下面的原因(见表1)。
表1 基线漂移的原因及解决方法
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原因 |
解决方法 |
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柱温波动 |
控制好柱子和流动项的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱 |
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流通池被污染或有气体 |
用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子），如需要，可用1mol/l的硝酸（不要用盐酸）冲洗 |
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紫外灯能量不足 |
更换新的紫外灯 |
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流动相污染、变质或有低品质溶剂配成 |
检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂 |
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样品中有强保留的物质（高K值）以馒头 峰样被洗脱，从而表现出一个逐步升高的基线 |
使用保护柱，如有必要，在进样之前；在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子 |
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检测器没有设定在最大吸收波长处 |
将波长调整至最大吸收波长 |
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流动相的PH值没有调节好 |
加适量的酸或碱调至最佳PH值 |
1．2 保留时间漂移
保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西．两次的保留时间相差不要超过15s，超过了30s可看做保留时间漂移，就无法进行定性，要考虑以下原因(见表2)。
表2 保留时间漂移的原因及解决方法
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原因 |
解决方法 |
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温控不当 |
调好柱温．检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱 |
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流动相比例变化 |
检查四元泵的比例阀是否有故障 |
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色谱柱没有平衡 |
在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 |
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流速变化 |
重新设定流速 |
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泵中有气泡 |
从泵中除去气泡 |
2. 峰形异常问题
峰形问题是液相的主要问题．在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰形，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，逐一加以解决(见表3)。
表2 峰形异常情况的分析及部分解决方法
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出现情况 |
问题分析及部分解决方法 |
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色谱图中未出峰 |
系统未进样或样品分解，泵未输液或流动向不正确。检测器设置不止确。针对以上情况成因作相应调整即可 |
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一个峰或几个峰是负峰 |
流动相吸收本底值高，进样过程中进入空气，样品组分的吸收低于流动相 |
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所又峰均为负峰 |
信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒，光学装置尚未达到平衡 |
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所又峰均为宽峰 |
系统未达到平衡，溶解样品的溶剂极性比流动相差很多，色谱主尺寸及类型选择不正确，色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响 |
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所出峰比预想的小 |
样品粘度过大，进样故障或进样体积误差；检测器设置不正确；定量环体积不正确；检测池污染：检测器灯出现问题 |
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出现双峰或肩峰 |
进样量过大，样品浓度过高，色谱柱或保护柱柱头堵塞，色谱柱或保护柱污染或失效，柱塌陷或形成短通道 |
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前伸峰 |
进样量大或样品浓度高：溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效 |
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拖尾峰 |
柱超载，降低样品量，怎加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤，调整流动相：硅羟基作用，加入 乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值：柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；使体积或柱外体积过大．将连接点降至最低：尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保拖尾峰护柱．对柱子进行再生 |
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出现平头峰 |
检测器设置不正确：进样体积太大或样品浓度太高 |
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出现鬼峰 |
西稃丙有残余．在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理：流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤：尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除 |
3.判别毛细管柱子的热稳定性好坏的方法
答：3.1、分配容量(或容量因子)K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好。
3.2、理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定
3.3、柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。
3.4、噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加.
3.5、 柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。
4.进样器内的玻璃衬套主要作用：
4.1、提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。
4.2、玻璃的惰性不如不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。
4.3、易于拆换清洗 ，以保持清洁的汽化室表面，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。
4.4、可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用更换整个进样加热块。从以上几个方面可以知道玻璃衬套对色谱行为造成影响的原因。
结语
以上只是对液相色谱常见的问题进行了分析．当然在实际应用中还会遇到更多的问题，在排除故障时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系：如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费；养成良好的记录习惯．这是成功进行故障排除的关键。总之．在使用高效液相色谱仪时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养。
